Το Open Antibodies Project είναι μια παγκόσμια ερευνητική συνεργασία που προωθείται από κοινού από τους UC Davis, NIH NeuroMab Facility, DSHB και Addgene. Στοχεύει στην αντιμετώπιση της κρίσης αναπαραγωγιμότητας αντισωμάτων μέσω της τυποποίησης, της διαφάνειας και της ανοιχτής κοινής χρήσης. Η υλοποίησή της δεν είναι μια χαλαρή πρωτοβουλία, αλλά μια διαδικασία μηχανικής έξι-βημάτων που είναι εκτελέσιμη, ελεγχόμενη και αναπαραγώγιμη.
1. Τυποποιημένη απόκτηση και υποβολή γονιδιακών αλληλουχιών αντισωμάτων
Πηγή: Τα ειδικά Β κύτταρα-αντιγόνου απομονώνονται από ανοσοποιημένα ζώα ή ασθενείς που έχουν αναρρώσει χρησιμοποιώντας τεχνολογία ταξινόμησης μεμονωμένων κυττάρων Β (όπως FACS). Το BCR mRNA εξάγεται και ενισχύεται με RT-PCR για να ληφθούν οι πλήρεις αλληλουχίες V(D)J της βαριάς και της ελαφριάς αλυσίδας.
Απαιτήσεις μορφής: Η αλληλουχία πρέπει να είναι σε μορφή FASTA και να περιλαμβάνει σχολιασμούς για τα θραύσματα γονιδίων V, D και J.
Πρέπει να περιλαμβάνονται πληροφορίες για το ανοσογόνο (ονομασία αντιγόνου, είδος, διαδικασία ανοσοποίησης).
Πρέπει να αναφέρεται η προέλευση της κλωνοποίησης (π.χ. "ανθρώπινος δότης #27, μετά από-SARS-λοίμωξη CoV-2").
Πλατφόρμα υποβολής: Υποβάλετε ακατέργαστα δεδομένα ακολουθίας μέσω της φόρμας "Προτείνετε ένα πλασμίδιο" της Addgene.
Βασικά σημεία: Η αλληλουχία πρέπει να είναι ένα ανασυνδυασμένο γονίδιο αντισώματος. Απαγορεύεται η υποβολή αντισωμάτων χωρίς αλληλουχία που προέρχονται από υβριδώματα.
2. Κατασκευή πλασμιδίου και διανυσματική διάταξη μηχανικής έκφρασης
Επιλογή φορέα: Χρησιμοποιήστε τυπικούς φορείς έκφρασης θηλαστικών (π.χ. pCMV ή pEF1), διασφαλίζοντας τη συμπερίληψη της σταθερής περιοχής IgG1 Fc και της αλληλουχίας Kozak.
Μέθοδος κλωνοποίησης: Χρησιμοποιήστε τη διάταξη Gibson ή την κλωνοποίηση Golden Gate για να επιτύχετε φυσικό ζευγάρωμα βαριών και ελαφρών αλυσίδων, αποφεύγοντας τυχαίους συνδυασμούς.
Συμβάσεις ονομασίας πλασμιδίου:
OpenAb_[Antigen]_[Είδη]_[CloneID]_v1
Παράδειγμα: OpenAb_SARS2_Spike_hu_047_v1
3. Υποβολή και αναθεώρηση μέσω της πλατφόρμας Addgene
Καταχώριση υποβολής: Πρόσβαση στη φόρμα Addgene Suggest a Plasmid
Κριτήρια επανεξέτασης: Αλληλουχία χωρίς μόλυνση και μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου. Το πλασμίδιο περιέχει πλήρη υποκινητή και τερματιστή. Παρέχετε έναν χάρτη πλασμιδίου (αρχείο .gb)
Χρόνος επανεξέτασης: Συνήθως 7–14 εργάσιμες ημέρες. Μετά την έγκριση, εκχωρείται ένα ID Addgene (π.χ. #123456) και το πλασμίδιο προστίθεται δημόσια στη βάση δεδομένων.
Αποτέλεσμα: Το πλασμίδιο γίνεται ένας παγκόσμιος πόρος με δυνατότητα αναζήτησης, διαθέσιμος δωρεάν σε οποιονδήποτε ερευνητή.
4. Τυποποιημένη Δημιουργία και Μεταφόρτωση Δεδομένων Επικύρωσης
Μέθοδοι επικύρωσης: Πρέπει να συμμορφώνονται με τους πέντε πυλώνες του IWGAV (Διεθνής Ομάδα Εργασίας για την Επικύρωση Αντισωμάτων):
|
Τύπος επικύρωσης |
Μέθοδος |
Απαιτήσεις |
|
Γενετική Επικύρωση |
CRISPR knockout/knockdown της πρωτεΐνης στόχου |
Εξαφάνιση ή σημαντική μείωση των ζωνών WB |
|
Ορθογώνια επικύρωση |
Σύγκριση με φασματομετρία μάζας ή αποτελέσματα αλληλουχίας RNA- |
Συνεπές μοτίβο έκφρασης |
|
Ανεξάρτητη επικύρωση αντισωμάτων |
Διασταυρούμενη-επικύρωση με χρήση αντισωμάτων με διαφορετικούς επιτόπους |
Συνεπή αποτελέσματα |
|
Λειτουργική επικύρωση |
Δοκιμασία εξουδετέρωσης, κυτταρομετρία ροής |
Επιδεικνύει αναμενόμενη βιολογική λειτουργία |
|
Επικύρωση εφαρμογής |
IHC, IF, WB, FC |
Ειδική χρώση για την εφαρμογή-στόχο |
Μορφή δεδομένων:
Εικόνες IHC/IF: Πρέπει να περιλαμβάνει αρνητικό μάρτυρα (ιστός νοκ-άουτ) και θετικό μάρτυρα.
Εικόνες WB: Πρέπει να περιλαμβάνουν δείκτες μοριακού βάρους και εσωτερικούς ελέγχους (π.χ. -ακτίνη).
Όλες οι εικόνες πρέπει να μεταφορτωθούν σε μορφή TIFF χωρίς απώλειες, μαζί με πειραματικές παραμέτρους (αναλογία αραίωσης αντισωμάτων, χρόνος έκθεσης).
Υποχρεωτική απαίτηση: Όλα τα δεδομένα επικύρωσης πρέπει να δημοσιεύονται σε συνδυασμό με πλασμίδια. ούτε είναι ανεκτίμητο.
5. Παγκόσμια δωρεάν διανομή και χρήση
Μέθοδος πρόσβασης:
Επισκεφτείτε τη Συλλογή Πλασμιδίων Αντισωμάτων Addgene
Αναζήτηση για το αντίσωμα στόχο (π.χ. "OpenAb_SARS2_Spike")
Υποβάλετε ένα συμφωνητικό μη εμπορικής χρήσης (δεν απαιτείται πληρωμή)
Λήψη πλασμιδίου (συνήθως 5–10 εργάσιμες ημέρες)
Οδηγίες χρήσης:
Το αναγνωριστικό Addgene και η αρχική πηγή ακολουθίας πρέπει να αναφέρονται στο έγγραφο.
Ενθαρρύνετε την υποβολή νέων δεδομένων επικύρωσης πίσω στο Addgene για να σχηματιστεί ένα οικοσύστημα κλειστού-βρόχου.
6. Συνεχής ανατροφοδότηση και επανάληψη οικοσυστήματος
Μηχανισμός ανάδρασης δεδομένων: Οι χρήστες ανεβάζουν νέα πειραματικά αποτελέσματα (π.χ. νέες εφαρμογές, αντιδραστικότητα νέων ειδών) στην πλατφόρμα Addgene, σχηματίζοντας μια βάση δεδομένων δυναμικής επικύρωσης.
Κοινοτική διακυβέρνηση: Το DSHB και το NIH δημοσιεύουν τακτικά αναφορές ποιότητας αντισωμάτων, εξαλείφοντας τα αναποτελεσματικά ή τα διασταυρούμενα{0}}αντισώματα.
Αποτελέσματα: Από το 2025, το 89% της έρευνας που χρησιμοποιεί αντισώματα ανοιχτής-πηγής μπορεί να αναπαραχθεί ανεξάρτητα, ξεπερνώντας κατά πολύ το 45% για τα εμπορικά αντισώματα.
